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酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法分享
更新時(shí)間:2022-07-26 點(diǎn)擊量:1310
  酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)測(cè)定法是利用酶能專(zhuān)一而高效地催化化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì),通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)速度來(lái)檢知體液等生物樣品中某種酶的含量和活性的分析技術(shù)。
 
  一、酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的測(cè)定方式:
 
  酶促反應(yīng)速度的測(cè)定可采用兩種方式:
 
  一、測(cè)定完成一定量反應(yīng)所需的時(shí)間;二、測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)的酶促反應(yīng)量。前者稱(chēng)為終點(diǎn)法,后者稱(chēng)為動(dòng)力學(xué)法。
 
  1.終點(diǎn)法
 
  該方式是在特定條件下,將樣品中要檢知的酶作用一定量的底物,然后根據(jù)反應(yīng)進(jìn)行到某一程度(即達(dá)到某一指標(biāo))所需要的時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)估計(jì)酶的活力。
 
  其一個(gè)發(fā)展是采用檢測(cè)器對(duì)反應(yīng)進(jìn)行連續(xù)跟蹤,并在反應(yīng)達(dá)到某一程度時(shí),精確地自動(dòng)記錄所需要的時(shí)間,這就是酶分析自動(dòng)化中的固定濃度法;另一個(gè)發(fā)展是作成簡(jiǎn)便的酶檢測(cè)紙片。
 
  2.動(dòng)力學(xué)法
 
  該方式測(cè)定原理是:在一定條件下,酶促反應(yīng)速度和酶濃度成正比,因此測(cè)得反應(yīng)速度就需要求得酶濃度。待測(cè)的酶濃度是影響反應(yīng)速度的因素,其他因素都應(yīng)處于較適于酶發(fā)揮催化作用的水平,為此應(yīng)選擇適宜的底物濃度、緩沖體系、溫度,并向反應(yīng)系統(tǒng)中添加必要的輔助因子。
 
  二、酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的測(cè)定方法:
 
  常用的測(cè)定方法有取樣法和連續(xù)法。
 
  取樣法是在酶反應(yīng)開(kāi)始后不同的時(shí)間,從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量的反應(yīng)液,并用適當(dāng)方法停止其反應(yīng),再根據(jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的差別進(jìn)行分析,求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)的變化量。
 
  連續(xù)法則是基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同,在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)添加酶的變性劑以終止反應(yīng)。常用的連續(xù)測(cè)定法是光吸收測(cè)定法,即根據(jù)產(chǎn)物和底物在某一波長(zhǎng)或波段上有明顯的特征吸收差別而建立起來(lái)的連續(xù)觀測(cè)方法。幾乎所有的氧化還原酶都可用此法測(cè)定,此外如熒光法、旋光法、電化學(xué)法也是常用的連續(xù)測(cè)定方法。
 
  對(duì)不易直接測(cè)定的反應(yīng),可使用酶偶聯(lián)分析法,即用過(guò)量、專(zhuān)一的"偶聯(lián)工具酶",使被測(cè)反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行到某一可直接測(cè)定的階段。

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